大体积转染是结合通盘这个词细胞和基因休养过程的热切用具，不管是早期商量、临床前阶段一经先进休养药物（ATMP）的出产。

跟着细胞和基因休养向临床升沉鼓动，边界化智商无疑成为一项必备条目。此外，记载工艺中所用原材料是否稳妥GMP法式以确保患者安全也变得越来越热切。

不管您仍处于商量阶段一经向临床或交易化迈进，4D-Nucleofector® LV单位王人能匡助您应付这些挑战。该系统相沿阻塞式、可彭胀的转染，最高可达10亿细胞，并提供用于商量用途和GMP出产的耗材，以及稳妥21 CFR part 11条目的软件。

4D-Nucleofector® LV单位在其非病毒、离体细胞和基因休养过程中高效修饰大体积细胞。该时刻的哄骗范围涵盖从商量到临床阶段，包括mRNA、CRISPR敲除、碱基或先导剪辑等多种方法。

4D-Nucleofector® LV单位与碱基剪辑

Chiesa等东说念主（2023）

《碱基剪辑的CAR7 T细胞休养复发性T细胞急性淋巴细胞白血病》

《新英格兰医学杂志》389(10):899-910

阶段：I期临床查验

疾病：急性淋巴细胞白血病（ALL）

休养：CAR-T细胞（异体）

基因修饰方法：

作家结合碱基剪辑（胞苷脱氨）灭活CD52、CD7和TCR β链以小心移植物抗宿主病，随后通过慢病毒整合CD7特异性CAR。碱基剪辑口头中，健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）经2天激活后，使用4D-Nucleofector® LV单位转染coBE mRNA（编码碱基剪辑器卵白：一种催化受损的Cas9切口酶与大鼠开头的单链DNA脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶交融）及靶向TRBC1和TRBC2的sgRNA。次日，细胞进行CAR插入的转导，培养10天后冷冻保存。CD52、CD7和TCR的敲除效率为92%至99%。

在I期查验中，3名复发性ALL儿童禁受了这种异体CAR-T细胞休养的安全性评估。商量考据了碱基剪辑手脚休养方法的可行性，但也指出了免疫休养中可能出现的并发症。

Woodruff等东说念主（2023）

《大边界出产碱基剪辑的嵌合抗原受体T细胞》

《分子休养方法与临床发展》31:101123

阶段：临床前

疾病：N/A

休养：CAR-T细胞（异体）

基因修饰方法：

商量东说念主员通过碱基剪辑敲除健康供体T细胞中的PD-1，随后用慢病毒转导抗CD19 CAR。在碱基剪辑中，他们相比了线性mRNA与环状mRNA的终止。小边界考据后，将哄骗彭胀至大边界出产临床剂量的1×108 CAR-T细胞。简言之，经2天激活的PBMCs或CD4+/CD8⁷ T细胞以5×10⁷ mL的浓度转染不同量的BE4max环状RNA和靶向PD-1的sgRNA。转染后一天，细胞进行抗CD19 CAR转导，再培养9天。把柄环状mRNA用量，碱基调理效率为86%至接近十足调理。

作家评释，在临床边界下使用环状mRNA能以8倍更少的RNA兑现更高的剪辑效率，从而显赫裁汰资本。

Georgiadis等东说念主（2021）

《碱基剪辑的CAR T细胞用于T细胞恶性肿瘤的斡旋休养》

《白血病》35(12):3466-3481

阶段：临床前

疾病：T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）

休养：CAR-T细胞（异体）

基因修饰方法：

伦敦大学学院的商量团队通过碱基剪辑（或CRISPR NHEJ）敲除TCR/CD3和CD7，随后慢病毒引入CAR。敲除CD3和CD7旨在幸免休养T细胞恶性肿瘤时的“自相残杀”。简言之，从健康供体分别PBMCs并激活，随后用靶向TCR恒定β链（TRBC）和CD7的sgRNA及SpCas9 mRNA或coBE3 dCas9 mRNA通过4D-Nucleofector® LV单位转染。24小时后，细胞用慢病毒载体转导，抒发靶向CD3（3CAR）和CD7（7CAR）的CAR。终止表示，CAR抒发肃肃，TCRαβ/CD3和CD7的名义抒发单敲除效率为50%至>95%，双敲除为37%至60%。3CAR和7CAR共培养可兑现“自我富集”，赢得99.6% TCR–/CD3–/CD7–细胞群体。这些细胞阐明出特异性细胞毒性，无脱靶活性或碱基调理问题。3CAR和7CAR T细胞还在东说念主源化小鼠异种移植模子中评估了抗白血病服从。

4D-Nucleofector® LV单位与CRISPR敲除

Ottoviano等东说念主（2022）

《CRISPR工程化CAR19通用T细胞休养难治性B细胞白血病儿童的I期临床查验》

《科学升沉医学》14, eabq3010

阶段：I期临床查验

疾病：B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）

休养：CAR-T细胞（异体）

基因修饰方法：

作家结合慢病毒引入靶向CD19的CAR和CRISPR gRNA（靶向TRAC和CD52），并通过非病毒方式传递Cas9 mRNA。简言之，健康供体的PBMCs激活1天后，用慢病毒载体转导编码抗CD19 CAR基因及靶向TRAC和CD52的sgRNA以兑现多重剪辑。3天后，细胞通过4D-Nucleofector® LV单位转染Cas9 mRNA。转染后，细胞进一步扩增，7天后通过磁珠去除残留的TCRαβ抒发T细胞。该方法兑现了86%至98%的CAR19抒发，残留TCR抒发为0.1%至1%。

在I期临床查验中，6名难治/复发性CD19阳性B-ALL儿童禁受了休养。商量评释了CRISPR免疫疗法的可行性、安全性和休养后劲，其中2名儿童病情缓解。

Vazquez-Lombardi等东说念主（2022）

《通过功能筛选的高通量T细胞受体工程松懈出服从和特异性增强的候选分子》

《免疫》55:1953–1966

阶段：商量

疾病：N/A

休养：TCR

基因修饰方法：

本商量旨在开辟一种识别高服从和高特异性工程化T细胞受体（TCR）的方法。建立的“TCR引擎”高通量方法结合了CRISPR基因组剪辑、诡计TCR遐想和深度测序。简言之，通过CRISPR-Cas使用小边界4D-Nucleofector® X单位修饰Jurkat细胞，生成TCR受体细胞系（TnT）。通过五步一语气整合Cas9、东说念主CD8、NFAT-GFP和mRuby（通过HDR），并删除内源性CD4、TCRα和Fas（通过NHEJ）。每一步后，通过流式分选细胞并测序考据。随后遐想靶向MAGE-A3（TCR-A3）的>30种突变TCR变体的组合HDR模板库，与靶向内源性TCRβ的gRNA一说念通过4D-Nucleofector® LV单位转染1亿TnT细胞。通过详尽筛选步调松懈出主倡导别增强的TCR变体，并在原代T细胞中进一步考据其安全性和服从。

Lattanzi等东说念主（2021）

《东说念主类造血干细胞中β-珠卵白基因修订的开辟手脚镰状细胞病的潜在握久休养》

《科学升沉医学》13(598):eabf2444

阶段：临床前（相沿IND的商量）

疾病：镰状细胞病（SCD）

休养：基因修订

基因修饰方法：

商量东说念主员结合非病毒电穿孔寄递CRISPR RNP和重组腺关系病毒寄递HDR模板，修订导致SCD的β-珠卵白（HBB）基因点突变。临床边界下，60%的HBB等位基因得到修订。移植至NSG小鼠后不雅察到20%的基因修订，且未发现基因毒性或致瘤性。

4D-Nucleofector® LV与病毒出产

Nawandar等东说念主（2022）

《通过合成基因组重组抒发出产的东说念主轻细恙毒》（bioRxiv预印本）

阶段：商量

疾病：N/A

基因修饰方法：

轻细恙毒（Anelloviruses）在东说念主类中大王人存在，但免疫原性较低且不致病。因此，基于这些病毒开辟基因疗法可能成为其他常用病毒的有劲替代有贪图，并允许重迭给药。现在，由于空泛体出门产该病毒的系统，其生物学特点尚未得到鄙俗商量。

本商量通过转染T细胞开头的MOLT-4细胞系，见效兑现了两种β扭转病毒（Betatorquevirus，轻细恙毒属之一）的重组出产。施行中使用的质粒编码该病毒属的LY2基因组或nrVL4619基因组。简而言之，小边界查验（转染1000万细胞）后，进一步扩大出产边界：使用4D-Nucleofector® LV Unit系统，在20 mL一语气流工艺中转染20亿细胞（质粒用量2 mg）。分析本体包括病毒基因抒发、复制、电子显微镜成像以及组织特异性体内感染施行。该职责为这一后劲病毒眷属的后续商量奠定了基础。

大体积转染模块: 4D-Nucleofectorm LV 模块上风

-阻塞的系统-核转染细胞数目多达109个边界可真确放大

-以少许样品建立最优方法熟悉的转染有贪图

-最初700多个优化细胞类型操作简短-极少的培训需求

-4D-Nucleofector LogWare-可使用稳妥21CFR part 11的软件进行操作

-TheraPEAK Nucleofector耗材-加速温情GMP过程条目的进程凯时体育游戏app平台